产品货号：
SK267-2
中文名称：
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)测试盒(紫外分光光度法)
英文名称：
产品规格：
25管/24样|50管/48样
发货周期：
1～3天
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- 在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；
- PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；
- 在340nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。
可见-紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
| 组分 | 25管/24样 | 50管/48样 | 保存 |
| 提取液一：液体 | 25mL | 50mL | 4℃ |
| 提取液二：液体 | 25mL | 50mL | |
| 试剂一 | 30mL | 60mL | |
| 试剂二：粉剂 | 1瓶 | 1瓶 | -20℃ |
| 试剂三：粉剂 | 1瓶 | 1瓶 | |
| 试剂四：粉剂 | 1瓶 | 1瓶 |
- 试剂二溶液：临用前加入两个规格分别加入12.5mL、25mL试剂一，充分混匀待用；
- 试剂三溶液：临用前加入两个规格分别加入12.5mL、25mL试剂一，充分混匀待用；
- 试剂四溶液：临用前加入两个规格分别加入1.25mL、2.5mL试剂一，充分溶解待用。
注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。
- 总Rubisco酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
- 胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离：按照植物组织质量(g)∶提取液体积(mL)为1∶5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。
建议测定总Rubisco酶活性，按照步骤a提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤b提取粗酶液。
- 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
- 样本测定
- 工作液的配制：临用前将试剂二溶液和试剂三溶液1∶1混合，用多少配多少；
- 在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂四溶液和900μL工作液，混匀，立即记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
- 工作液的配制：临用前将试剂二溶液和试剂三溶液1∶1混合，用多少配多少；
- 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中1mg蛋白1min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/mg蛋白)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。 - 按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中1g组织1min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=643×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义：
V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V样：加入样本体积，0.05mL；
V样总：加入提取液体积，1mL；
T：反应时间，5min；
W：样本质量，g。
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